Tip:
Highlight text to annotate it
X
Velkommen til Novus Visual Protocol Serien.
I denne video vil vi lære at udføre alle faser af en Western Blot, ved hjælp af
de mest almindelige metoder til denne prøve.
Før vi kan begynde at forberede blottet må vi først forberede vores prøve lysat.
I dette eksempel vil vi udarbejde et protein lysat fra dyrkede celler.
Her
har vi vasket cellerne to gange med iskoldt PBS
og tilstrækkelig lysis buffer til at dække cellerne.
Valget af lysis buffer afhænger i høj grad af dit
valg af interesse protein.
Vi skraber cellerne og overføre celle-opløsningen til et centrifuge rør
der er anbragt på is.
For at opløse membranbundne proteiner, vil vi kræve stærkere
ekstraktion detergenter sammenlignet med isolerede cytoplasmiske proteiner.
I dette eksempel
vil vi bruge en standard RIPA buffer,
som er en almindelig buffer til opnåelse af maksimal proteinudbytte. Under udvinding
af proteiner fra alle cellulære lokaliseringer,
er det meget vigtigt at inkludere proteaseinhibitorer i din lysis buffer, som vil
forebygge forringelse af din prøve. Brug altid frisklavet protease
hæmmere, opbevar prøver på is og arbejd hurtigt.
Vi lysere cellerne ved pipettering op og ned
efterfulgt af inkubering på is i 30 minutter.
Centrifugér cellerne til en pellet.
Kassér pelleten og indsaml supernatanten. Dette er din lysat.
Bestem den samlede koncentration af dit protein lysat ved
afprøvning af en lille del af din lysat
med et kommercielt tilgængeligt protein kvantificering prøve,
såsom BCA.
Dette vil hjælpe dig med at flytte lige store mængder af protein til din gel.
Western blots er traditionelt lavet under reducerede og denaturerede
betingelser. Disse forhold vil tillade proteiner at være adskilt fra deres
molekylevægt
snarere end deres primære konformationel form eller ladning.
For at reducere og denaturere prøver,
fortyndes hvert protein i en loading buffer, såsom den traditionelle Laemmli-buffer.
Denne buffer indeholder beta-mercaptoethanol, eller DTT, til at reducere disulfid kamme
mellem cysteiner,
brug SDS som hjælp ved denatureringen af et negativt protein,
brug glycerol for at tillade prøverne at synke ned i hver brønd
og brug bromphenolblåt til at visualisere lysatet og en ikonisk buffer.
Votex hver prøve og inkuber ved 95 ° C i fem minutter til
proteinerne er fuldstændigt denatureret. Du er nu klar til at lægge dine prøver
i en SDS PAGE gel.
Til det næste trin vi vil adskille de individuelle proteiner i vores prøve
lysat
baseret på deres molekylevægt
ved hjælp af en positiv elektrode for at tiltrække et negativt ladet protein.
For at gøre dette
flytter vi vores tidligere fremstillede proteinprøver til en kommercielt tilgængelig
polyacrylamidgel.
Gels er tilgængelige i faste procentsatser eller gradinenter af acrylamid.
Jo højere acrylamid, desto mindre gel
procent.
Derfor er højere procentkrav geler bedre for lav vægt proteiner, lav procent
geler er bedre for stor vægt proteiner og gradientgeler kan anvendes til
proteiner af alle størrelser
på grund af deres varierende porestørrelse.
Forbered din gel ved at indsætte det i elektroforeseapparatet og
fyld med løbebuffer, der er relevant for din gel kemi.
Skyl brøndene i gelen med løbebuffer og tilsæt buffer til
kamrene.
Fyld dine prøver i brøndene.
Hvis du er usikker på mængden,
foreslår vi 10-30 mikrogram totalt protein som et startpunkt
såvel som hele mængden af prøve fyldet.
Du vil også være nødt til at reservere mindst en brønd for den forud-farvet molekylevægt
stige.
Stigen vil give dig mulighed for at overvåge protein adskillelse under
elektroforese og efterfølgende kontrollere protein vægt i din prøve under
senere analyse.
Luk elektroforese enheden og tilslut den til en strømforsyning. De fleste enheder
kører typisk 45-60 minutter ved 200 volt
eller indtil løbebufferen når bunden af gelen.
I dette tidsrum vil de negativt ladede proteiner i hver prøve migrere mod
den positivt ladede elektrode og finde deres vej gennem polyacrylamid
gelmatrixet.
I det næste trin, vil vi overføre vores separate proteiner ud af gelen
og ind i en fast membran eller blot.
Dette er baseret på samme princip som det foregående trin
hvor et elektrisk felt er opladet til at fjerne de negative proteiner
mod en positiv elektrode.
Overførsel kan ske under våde eller semi-tørre forhold.
Her vil vi vise den traditionelle våde overførselsmetode. Start med at fjerne
gelen fra kassetten
ved at skære den øverste del indeholdende brøndene af.
Lav et hak i øverste venstre hjørne for at angive gel-orientering.
Flyd gelen i overførelses buffer, mens du forbereder en overførelses sandwich.
For at lave en overførsels sandwich
får du brug for en kassette,
svamp, filtrerpapir
samt gelen
og dit valg af enten PVDF eller nitrocellulous membran.
PVDF skal først aktiveres ved at gennemvæde membranen i ethanol i
to minutter. Men bortset fra dette, er PVDF eller valg af nitrocellulous
membran en personlig præference.
Hak i øverste venstre hjørne for at angive blot orientering
og inkuber membranerne i overførelses buffer i 10 minutter.
Lav en stak ved at placere de følgende komponenter
fra den sorte negative katode til rød positive anode:
svamp,
filtrerpapir,
membran,
(Pas på ikke at røre ved gelen eller membranen med dine bare hænder og brug
en ren pincet eller spatel i stedet.
en ren pincet eller spatel i stedet.
overdrevet baggrundssignal. ),
filtrerpapir
og svamp.
Brug en ren rulle med hvert lag til forsigtigt at rulle eventuelle bobler, der kan være
dannet ud,
da boblerne vil inhibere effektiv protein overførelse.
Lås kassetten og læg den i gel-tank-apparatet, der indeholder kulde
overførsels buffer,
og sørg for at kassetten er placeret korrekt - fra negativ til positiv.
For at forhindre overophedning, er det fordelagtigt at overføre med en kold
pakke i apparatet
eller i et koldt rum med spinder-baren placeret i bunden af kammeret.
Kammeret lukkes og forbindes til en strømforsyning.
Udfør overførslen ifølge producentens instruktioner, som normalt
er 100 volt for 30-120 minutter.
Efter den elektriske overførelse af vores proteiner til en membran, vil vi
nu blokere blottet,
anvend et primært antistof specifikt for vores interesse protein og derefter et sekundært
antistof, som genkender det primære antistof.
Start med at fjerne membranen fra kassetten og skyl tre gange i vand.
Som et valgfrit trin kan man kontrollere at proteinerne blev overført med succes
ved at farve membranen med Ponceau red.
Inkuber membranen med Ponceau i fem minutter og vask med vand, indtil
båndene er klare.
Efter godkendelsen
kan farven blive fjernet fra blottet ved fortsat at vaske med vand
eller TBS twine
indtil farvestoffet er helt fjernet.
Vi skal blokere alle områder af blottet som ikke indeholder protein.
Dette vil forhindre ikke-specifik binding af antistoffet og reducere det samlede
baggrundssignal.
Almindelige blokerings buffere indbefatter 5% fedtfattig tørmælk til prøven
i en TBS twine opløsning.
Men brug ikke mælk ved testning med phospho specifikke antistoffer,
da det kan forårsage højt baggrundssignal fra dets endogene phosphoprotein, cæsium.
Inkuber membranen med blokerings opløsning i en time ved stuetemperatur
temperatur
under let omrøring.
Dekanter blokerings opløsningen og vask med TBS twine i fem minutter.
Vi er nu klar til at tilføje vores antistof. Fortynd det primære antistof i en
blokeringsbuffer ved koncentrationen anbefalet på dataarket.
Inkuber natten over ved 4 grader Celsius med forsigtig rystning.
Et anbefalet valgfrit trin er; brug også et positivt kontrol-antistof
som tillader brugeren at kontrollere, at lige store mængder af samlet protein blev fyldt i
hver brønd og som hjælper ved fejlfinding, ved at fjerne enhver
usikkerhed ved Western Blot procedure.
Den næste dag,
dekanteres det primære antistof fra og membranen vaskes med store mængder
TBS twine og kraftig omrøring,
fem gange i fem minutter hver.
Disse voldsomme vaske er ekstremt vigtigt for at fjerne ikke-specifikke
baggrundssignaler.
Efter vask fortyndes det sekundære antistof i blokeringsopløsning og membranen
inkuberes i en time ved stuetemperatur i koncentrationen
anbefalet på dataarket.
I vores eksempel er den sekundære også konjugeret til HRP med henblik på senere
detektion.
Dekanter membranen og vask den sekundært med store mængder af TBS twine ved
kraftig omrøring, fem gange i fem minutter hver.
Du er nu klar til påvisnings fasen.
I den sidste fase vil vi vise signal-udvikling ved brug af den mest almindelige,
mest følsomme og billigste detektionsmetode af elektrokemiluminescens
(Eller ECL) reaktion.
Denne metode udnytter HRP enzymet,
som var konjugeret til den sekundære for at katalysere ECL reaktionen og producere
lys.
Et lys bliver derefter samlet på røntgenfilm og fremkaldt
eller digitaliseret ved hjælp af et specialiseret kamera, der er følsomt nok
til denne anvendelse.
Vi starter ved blanding af lige dele ECL reagenser i et en-til-en forhold
ifølge producentens instruktioner.
Vi vil inkubere membranen i 3-5 minutter uden omrøring.
Efter inkubationen, dekanteres ECL blanding. Bruge en laboratorium tørre til at tørre den overskydende
opløsning fra hjørnet af membranen.
Anbring membranen i klar plastfolie, såsom en ark-protektor for at forhindre,
tørring. Undgå at lade membranen tørre helt ud.
Vi kan nu bruge en rulle til at skubbe eventuelle bobler eller eventuel overskydende opløsning ud.
Udvikl membranen så hurtigt som muligt.
Både film og kamera systemer giver dig mulighed for manuelt at justere eksponeringens tiden
for at sikre en perfekt Western Blot.
Relative bånd densiteter kan nu kvantificeres med kommercielt tilgængelige
software.
Korrekt molekylevægt kan også kontrolleres ved at sammenligne båndstørrelser til
molekylevægt stigen.