Tip:
Highlight text to annotate it
X
Med de celler udpladet den foregående dag og dyrket natten over, er vi klar
at starte med ICC procedure.
På denne første dag i ICC, vil vi fastsætte,
permeabilisere,
Dup og tilføje et primært antistof til cellerne.
Starte ved sugning dyrkningsmedium fra hver brønd efterfulgt af fiksering af
celler med 4% formaldehyd og 10% formalin
i 10 minutter ved stuetemperatur.
Aspirere fikseringsmiddel og skylles hver brønd to gange med iskold PBS.
Vær forsigtig med ikke at lade cellerne tørre ud i dette
eller yderligere trin i protokollen.
Hvis epitopen Deres protein af interesse udtrykkes intracellulært,
cellulær permeabilisering er nødvendig for antistoffet at få adgang til den
celle.
Selvom der er mange forskellige permeabilisering midler, den mest almindelige
er fra 0,1 til 0,5% koncentration af Tween-20 eller
Triton-X100
fortyndet i PBS.
Tween-20 anvendes til epitoper placeret i cytoplasmaet
mens Triton-X100 anvendes til permeabilizing kernen og mitochondrier.
Inkuber brønde med permeabilisering puffer i 10 minutter ved stuetemperatur.
Aspirere permeabilisering puffer og vaskes tre gange i 5 minutter
hver med PBS sejlgarn.
PBS sejlgarn indeholder 0,1% Tween-20.
Vi vil nu blokere uspecifikke bindingssteder med blokeringsbuffer i 1 time
ved stuetemperatur.
Den bedste blokerende buffer PBST med 10% serum fra
vært arter af din sekundære antistof.
Kan imidlertid 1% BSA i PBST også anvendes.
Forberede det primære antistof ved at fortynde det i blokeringspuffer ved den anbefalede
fortynding angivet på dataarket.
Flere strammere fortyndinger er til gavn for højde for variable,
kan være anderledes i assayet, og
for at opnå de bedste resultater.
Inkuber ved 4 ° C natten over.
I vores eksempel, er vi da vi bruger en ukonjugeret primær vil bruge en fluorofor
konjugeret sekundært på dag to.