Tip:
Highlight text to annotate it
X
Efter elektrotransfer af vores proteiner til en membran, vil vi nu blokere
Blot,
anvende et primært antistof specifikt for vores proteinet af interesse og derefter et sekundært antistof
der genkender det primære antistof.
Start med at fjerne membranen fra kassetten og skylning tre gange i
vand.
Som et valgfrit trin kan man kontrollere blev proteinerne overført med succes
ved at farve membranen med Ponceau red.
Inkuber membranen med Ponceau i fem minutter og vaskes med vand, indtil
båndene er klare.
Efter kontrol blottet kan derpå de-stained ved fortsat at vaske med
vand eller TBS sejlgarn indtil farvestoffet er helt fjernet.
Vi skal blokere alle områder af blot, der ikke allerede indeholder protein.
Dette vil forhindre ikke-specifik binding af antistoffet og reducere den samlede
baggrundssignal.
Almindelige blokerende buffere indbefatter 5% ikke-fedtholdig tørmælk til assayet
i en TBS sejlgarn opløsning.
Men brug ikke mælk, når probing med phospho specifikke antistoffer, som det kan
forårsage høj baggrund fra dets endogene phosphoprotein, cæsium.
Inkuber membranen med blokeringsopløsning i en time ved stuetemperatur
under let omrøring.
Dekanteres blokerende opløsning og vask med TBS sejlgarn i fem minutter.
Vi er nu klar til at tilføje vores antistof. Fortynd det primære antistof i en
blokeringspuffer ved koncentrationen anbefalet på dataarket.
Inkuber natten over ved 4 grader Celsius med forsigtig rystning.
En anbefalet valgfrit trin er også anvende en positiv kontrol belastet antistof
som tillader brugeren at kontrollere lige store mængder af samlet protein blev fyldt i hver
godt og hjælpere i fejlfinding ved at fjerne eventuelle usikkerheder
med Western Blot procedure. Den næste dag, dekanteres fra det primære antistof og
Vask membranen med store volumener af TBS sejlgarn og kraftig omrøring
fem gange i fem minutter hver.
Disse strenge vasker er ekstremt vigtigt for at fjerne ikke-specifikke
baggrundssignaler.
Efter vask fortyndes det sekundære antistof i blokeringsopløsning, og
inkubere membranen i en time ved stuetemperatur i en koncentration
anbefalet på dataarket.
I vores eksempel den sekundære også konjugeret til HRP med henblik på senere
detektion.
Dekanteres membran og vaskes sekundært med store volumener af TBS sejlgarn med
kraftig omrøring fem gange i fem minutter hver. Du er nu klar til
detekteringsfase.