Tip:
Highlight text to annotate it
X
Velkommen til Novus Visual protokollen Series.
I denne video vil vi lære at udføre alle faser af en Western Blot ved hjælp af
mest almindelige metoder til dette assay.
Før vi kan begynde at forberede blottet må vi først forberede vores prøve lysat.
I dette eksempel vil vi udarbejde et protein lysat fra dyrkede celler.
Her har vi vaske cellerne to gange med iskoldt PBS og tilstrækkelig lysebuffer
at dække cellerne.
Valget af lysisbuffer afhænger i høj grad af lokalisering
Deres protein af interesse.
Vi skrabe cellerne og overføre cellen løsning på et centrifugerør
anbragt på is.
For at opløse membranbundne proteiner, vil vi kræve stærkere
ekstraktion detergenter sammenlignet med isolerede cytoplasmiske proteiner.
I dette eksempel anvender en standard RIPA-buffer, hvilket er en almindelig puffer
til opnåelse af maksimal proteinudbytte. Samtidig ekstraktion af proteiner fra alle
cellulære lokaliseringer,
er det meget vigtigt at inkludere proteaseinhibitorer i din lysisbuffer, der vil
forebygge forringelse af din prøve. Brug altid frisklavet protease
hæmmere, opbevare prøver på is og arbejder hurtigt.
Vi lus cellerne ved pipettering op og ned
efterfulgt af inkubering på is i 30 minutter.
Centrifugeres cellerne til en pellet.
Kassér pelleten og indsamle supernatanten. Dette er din lysat.
Bestem den totale proteinkoncentration din prøve lysat ved
*** en lille del af lysatet med et kommercielt tilgængeligt protein
mængdebestemmelse assay såsom BCA.
Dette vil hjælpe dig med at laste lige store mængder af protein i din gel.
Western blots traditionelt præformet under reduceret og denatureret
betingelser.
Disse forhold vil gøre proteiner at være adskilte ved deres molekylvægt
snarere end deres modersmål konformationel form eller afgift.
For at reducere og denaturere prøver,
fortyndes i et loading puffer, såsom den traditionelle Laemmli-puffer.
Denne puffer indeholder beta-mercaptoethanol, eller DTT, til at reducere disulfid
kamme mellem cysteiner,
SDS at bistå denaturering af et tilvejebringe en netto negativ protein,
glycerol for at tillade prøverne at synke ned i hver brønd,
bromphenolblåt at visualisere lysatet
og en ikonisk buffer.
Votex hver prøve og inkuberes ved 95 ° C i fem minutter til
fuldstændigt denaturere proteinerne. Du er nu klar til at lægge dine prøver i en
SDS PAGE-gel.