Tip:
Highlight text to annotate it
X
Velkommen til Novus Visual protokol serie.
I denne video kan du se, hvordan du udfører alle faser af flourescerende
immuncytokemi
ved hjælp af de mest almindelige metoder til denne prøve.
Før start af ICC proceduren, vil vi vise, hvordan man forbereder
dækglas og celledyrkningsmedie plader, efterfulgt af udpladning af vores celler.
Vi begynder med at syre behandle nye dækglas i en molær af saltsyre i
24 timer.
Efter forsigtig dekantering af syren og fjernelse af dækglas,
vaskes hvert enkelt med destilleret vand,
og skylles efterfølgende med ethanol.
Som et valgfrit trin kan du placere dækglassene i et stativ
og nedsænke det i
en 0,1 mg / opløsning gelatine eller polylysin
i fem minutter.
Disse overflade belægninger hjælper med til at give en bedre vedhæftning af celler til
dækglassene og
sikrer, at de ikke løsner sig under efterfølgende vasketrin.
Efter behandling fjernes stativet og dækglassene tørres i kultur-hætten
eller i en opvarmet ovn.
De rene, tørre dækglas indsættes derefter i hver sin brønd i en seks brønds
kulturplade
og dækket med et låg.
For at spare tid, kan store mængder af plader fremstilles i god tid til senere brug.
Pladerne kan også steriliseres ved at anbringe dem under hættens UV-lys.
Med rene dækglas fremstillet i de seks brønde,
kan vi nu tilføje vores celler.
Anbragt på glassene giver det en tæthed på en halv million celler pr. brønd.
Cellerne dyrkes derefter natten over i rugemaskinen eller indtil de når den ønskede
densitet.
Med de celler, der er udpladet den foregående dag og dyrket natten over, er vi klar
til at begynde ICC proceduren.
På denne første dag i ICC, vil vi fastsætte,
permeabilisere,
dup og tilføj et primært antistof til cellerne.
Start med at suge dyrkningsmedie fra hver brønd efterfulgt af fiksering af
cellerne med 4% formaldehyd og 10% formalin
i 10 minutter ved stuetemperatur.
Aspirer fikseringsmidlet og skyl hver brønd to gange med iskold PBS.
Vær forsigtig med ikke at lade cellerne tørre ud, på dette
eller under senere trin i protokollen.
Hvis epitopen i det ønskede protein udtrykkes intracellulært,
er cellulær permeabilisering nødvendig for at antistoffet kan få adgang til
cellen.
Selvom der er mange forskellige
permeabiliserings agenter, er de mest almindelige fra 0,1 til 0,5% i
koncentrationen
af Tween-20
eller Triton-X100
fortyndet i PBS.
Tween-20 anvendes til epitoper placeret i cytoplasmaet,
mens Triton-x100 anvendes til permeabilisering af kernen og mitochondrier.
Inkuber brøndene med permeabiliserings buffer i 10 minutter ved stuetemperatur.
Aspirer permeabiliserings buffer og vask tre gange 5 minutter, med
PBS twine.
PBS twine indeholder 0,1% Tween-20.
Vi vil nu blokere uspecifikke bindingssteder med blokeringsbuffer i 1 time
ved stuetemperatur.
Den bedste blokeringsbuffer er PBST med 10% serum fra vært arten
af dit sekundære antistof.
Imidlertid
kan 1% BSA i PBST også anvendes.
Forbered det primære antistof ved at fortynde det i blokeringsbufferen
med den anbefalede fortynding angivet i dataarket.
Flere kraftigere fortyndinger er gavnlige hvis man tager højde for variabler, der kan være
anderledes i din prøve,
og for at opnå de bedste resultater.
Inkuber ved 4 ° C natten over.
I vores eksempel,
da vi bruger en ukonjugeret primær, vil vi bruge en fluorofor
konjugeret sekundær på dag to.
På dag to af vores ICC procedure
vi vil tilføje vores sekundært antistof,
udføre en frivillig dobbelt mærkning og nuklear mærkning trin,
montere vores dækglas til dias,
og opnå billeder af vores antistoffer med et fluorescensmikroskop.
Først vil vi puste den primære antistof opløsning væk, efterfulgt af vask af cellen
med PBST tre gang 5 minutter hver.
Herefter forberedes floraform konjugeret sekundært antistof, der vil bindes til det primære
antistof.
Fortynd den sekundære blokeringspuffer
med den anbefalede fortynding angivet på dataarket
og inkuber ved stuetemperatur i en time.
Dækning af pladerne med folie forhindrer følsomme farvestoffer fra at degenerere.
Aspirer den sekundære antistof opløsning fra, efterfulgt af vask af cellerne
tre gange med PBST
i fem minutter hver.
Som et valgfrit trin kan et andet primært og sekundært par anvendes
til at visualisere et andet epitop
ved hjælp af en anden etage for det.
Desuden kan bindende DNA-farvestoffer såsom DAPI
anvendes uden behov for sekundære antistoffer.
Se den fulde skriftlige Novus protokol for yderligere oplysninger om, hvordan man kan fordoble og
tre-doble mærkning.
Dækglassene er nu klar til at blive sat i mikroskopet.
Tag et rent objektglas og dispenser en dråbe antiblegemiddel monteringsmedie ved langsomt
at presse stemplet ned i pipetten.
Fjern forsigtigt et dækglas fra brønden,
så overskydende væske kan dryppe af
og placer cellerne med forsiden ned mod objektglasset.
Klar neglelak kan anvendes til at forsegle dækglasset og forhindre det i
at udtørre.
Objektglassene kan nu ses under et mikroskop
eller opbevares ved -20 til +4 grader Celsius
i en mørk objektglas boks eller bog.
Begrænsning af den tid objektglasset er udsat for mikroskopets lys, vil hjælpe til
en forlængelse af det fluorescerende signal
og forhindre fotoblegning.